负载地塞米松二氧化钛纳米管缓释系统的构建

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.16.014

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (16): 2544-2549.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.16.014

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负载地塞米松二氧化钛纳米管缓释系统的构建

王明，张赫，王璐，邓锋，杨生

重庆医科大学口腔医学院修复科，口腔疾病与生物医学重庆市重点实验室，重庆市 401147

修回日期:2014-04-02 出版日期:2014-04-16 发布日期:2014-04-16
通讯作者: 杨生，博士，讲师，主治医师，重庆医科大学附属口腔医院修复科，口腔疾病与生物医学重庆市重点实验室，重庆市 401147
作者简介:王明，女，1987年生，重庆市人，汉族，重庆医科大学在读硕士，主要从事生物材料的研究。
基金资助:
重庆医科大学口腔医学院博士科研启动基金(2011)；重庆市卫生局面上项目(2012-2-121)；重庆市科委自然科学基金一般项目(CSTC2012jjA0178)；高等学校博士学科点专项科研基金新教师类资助课题(20125503120009)

Constructing a controlled-release dexamethasone-loaded titania nanotube system

Wang Ming, Zhang He, Wang Lu, Deng Feng, Yang Sheng

Department of Prosthodontics, Affiliated Hospital of Stomatology, Chongqing Medical University, Chongqing Key Laboratory for Oral Diseases and Biomedical Sciences, Chongqing 401147, China

Revised:2014-04-02 Online:2014-04-16 Published:2014-04-16
Contact: Yang Sheng, D.D.S., Ph.D., Attending physician, Lecturer Department of Prosthodontics, Affiliated Hospital of Stomatology, Chongqing Medical University, Chongqing Key Laboratory for Oral Diseases and Biomedical Sciences, Chongqing 401147, China
About author:Wang Ming, Studying for master’s degree, Physician, Department of Prosthodontics, Affiliated Hospital of Stomatology, Chongqing Medical University, Chongqing Key Laboratory for Oral Diseases and Biomedical Sciences, Chongqing 401147, China
Supported by:
Doctoral Startup Fund of College of Stomatology in Chongqing Medical University, No. 2011; the General Program of Chongqing Municipal Health Bureau, No. 2012-2-121; the Natural Science Foundation of Chongqing Science & Technology Commission, No. CSTC2012jjA0178; Specialized Research Fund for the Doctoral Program of Higher Education in China, No. 20125503120009

摘要/Abstract

摘要：

背景：相对于纯钛来说，二氧化钛纳米管除了具有促进骨髓间充质干细胞向成骨分化及提高骨整合速度的能力外，还可以作为纳米储存器负载药物。

目的：制备负载地塞米松的二氧化钛纳米管载药系统，检测其药物释放性能。

方法：采用电化学阳极氧化法制备二氧化钛纳米管。采用滴加法在二氧化钛纳米管表面负载地塞米松。利用层层自组装技术在负载地塞米松二氧化钛纳米管表面制备明胶/壳聚糖多层膜复合结构，扫描电镜观察及接触角测试检测明胶/壳聚糖多层膜结构，采用紫外分光光度计检测负载地塞米松二氧化钛纳米管表面涂覆明胶/壳聚糖多层膜后的药物释放性能。

结果与结论：扫描电镜见二氧化钛纳米管结构完整，管径大小均匀，约为70 nm，排列整齐。明胶/壳聚糖多层膜结构完全覆盖二氧化钛纳米管表面，成功封堵二氧化钛纳米管管口。负载地塞米松二氧化钛纳米管表面涂覆明胶/壳聚糖多层膜从第5层开始，接触角呈现一高一低交替变化的锯齿状。在最开始的3 h出现轻微的暴释现象，约32.7%的地塞米松释放出来，之后出现药物缓慢释放现象；24 h后，约52.3%的地塞米松释放出来；7 d后，仅有极少量药物从纳米管中释放出来，二氧化钛纳米管内保存的地塞米松为8.0%-10.0%。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 缓释材料, 二氧化钛纳米管, 阳极氧化, 地塞米松, 缓释, 明胶, 壳聚糖

Abstract:

BACKGROUND: Compared with smooth titanium, titania nanotubes cannot only induce mesenchymal stem cells osteogenic differentiation and promote bone integration, but also be used as drug nanocarriers.

OBJECTIVE: To prepare dexamethasone-loaded titania nanotube system and to test its drug release characteristics.

METHODS: Titania nanotubes were prepared by electrochemical anodic oxidation, and dexamethasone was dripped onto the prepared titania nanotubes. Subsequently layer by layer self-assembly technology was employed to fabricate gelatin/chitosan multilayered structure on the prepared samples. Scanning electron microscope and contact angle test were carried out during the process of building the gelatin/chitosan multilayered structure. The drug release was measured by a ultraviolet spectrophotometer.

RESULTS AND CONCLUSION: Under the scanning electron microscopy, the fabricated titania nanotubes had integral structure with even tube size of about 70 nm and arranged regularly, and the nanotubes were completely covered and sealed by the gelatin/chitosan multilayered membrane. Contact angle test results showed that ever since the fifth layer, contact angles changed alternately and displayed a zigzag profile. Ultraviolet spectrophotometer test results showed that when cultured for 3 hours, the cumulative drug release was about 32.7% and demonstrated an initial burst followed by sustained release. When cultured for 24 hours, the cumulative drug release about 52.3%. However, after cultured for 7 days, little drug release was detected. And there was about 8.0%-10.0% dexamethasone of initial loading preserved in nanotubes.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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Key words: biocompatiblematerials, nanotubes, dexamethasone

中图分类号:

R318

王明，张赫，王璐，邓锋，杨生. 负载地塞米松二氧化钛纳米管缓释系统的构建[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(16): 2544-2549.

Wang Ming, Zhang He, Wang Lu, Deng Feng, Yang Sheng . Constructing a controlled-release dexamethasone-loaded titania nanotube system[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(16): 2544-2549.

图/表（结果） 2

2.1 阳极氧化法制备的二氧化钛纳米管形貌 图1A示扫描电镜观察钛箔片的形貌，可见不规则微米级粗糙不平的结构。图1B示扫描电镜观察阳极氧化处理后的二氧化钛纳米管形貌，见垂直于钛基底的一端开口的纳米级管状结构，管径大小均匀，排列整齐，管径约为70 nm。

2.2 二氧化钛纳米管表面明胶/壳聚糖多层膜结构的形貌 图2A示二氧化钛纳米管表面已制备好的明胶/壳聚糖多层膜结构，已完全覆盖二氧化钛纳米管表面，封堵纳米管管口。图2B为二氧化钛纳米管表面已制备好的明胶/壳聚糖多层结构降解1 d后扫描电镜所观察到的形貌，先前完整的膜结构发生改变，逐渐降解，可见网状结构的形成。

2.3 接触角测试 图3所示为制备明胶/壳聚糖多层结构过程中的接触角测试的结果。管径70 nm的二氧化钛纳米管表面接触角约为(16.4±0.5)°，呈现出较好的亲水性；涂覆明胶及壳聚糖多层膜后样本接触角增大，疏水性增强。从第5层(明胶层)开始，接触角测试结果呈现出在(48.0±3.1)°与(65.3±1.6)°之间一高一低的交替变化，为较为规则的锯齿状。

2.4 药物释放 图4为地塞米松从二氧化钛纳米管明胶/壳聚糖复合结构中释放出来的药物释放曲线。前3 h累积释放药物为初始负载量的(32.7±1.5)%，前6 h累积释放(40.7±1.5)%，前12 h累积释放(43.7±1.5)%，前24 h(1 d)累积释放(52.3±2.5)%，前48 h(2 d)累积释放(70±1)%，前72 h(3 d)累积释放(71.7±1.5)%，前96 h(4 d)累积释放(74.3%±1.5)%，前120 h(5 d)累积释放(78±3)%，前144 h (6 d)累积释放(83.3±1.5)%，前168 h(7 d)累积释放(85.7±2.1)%，前240 h(10 d)累积释放(89.7±1.5)%，前 336 h(4 d)累积释放(91±1)%。前3 h出现轻微的暴释现象，之后出现药物缓慢释放现象，7 d后，仅有极少量的药物从纳米管中释放出来。二氧化钛纳米管内未释放出来的药物为8%-10%。

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引言

近年来，利用生物材料负载药物成为研究热点，如纳米颗粒^[1]、脂质体和聚合物胶束^[2]，纳米管等成为具有潜在应用价值的载体生物材料^[3-4]。纳米科技的发展加速了载体生物材料药物控释技术的发展，对于药学及生物工程学的发展具有推动作用，尤其在生物医学领域，将具有生物相容性或治疗价值的适当药物连接在生物材料表面可作为材料改性的重要方法，具有潜在的研究及应用价值。

相对于纯钛来说，二氧化钛纳米管除了自身具有促进骨髓间充质干细胞成骨向分化及提高骨整合速度的能力外，其还可以作为纳米储存器负载药物^[3-5]。Lai等^[3]利用二氧化钛纳米管作为药物储存器负载生物活性骨形态发生蛋白2，Hu等^[4]为进一步模仿胞外微环境，利用二氧化钛纳米管作为药物储存器负载骨形态发生蛋白2，并采用层层自组装技术构建明胶/壳聚糖多层结构以达到药物缓释的目的。在钛种植体表面制备药物缓释结构可以改善传统种植体的缺点，以达到定向、快速、可控的骨愈合^[5]。

地塞米松是一种合成的糖皮质激素，是一种疏水性的生物活性化合物，被广泛应用于组织工程中^[6]。地塞米松不仅能抑制炎症基因的表达，而且可诱导干细胞向成骨分化^[7-8]。Fratoddi等^[9]利用聚合物纳米颗粒负载地塞米松，显示出较好的生物学作用，负载地塞米松的纳米颗粒能抑制HeLa细胞凋亡。Su等^[10]使用胶原纤维负载地塞米松，胶原支架材料在小鼠动物体内显示出较明显促进细胞生长的作用，负载地塞米松后可促进干细胞向成骨分化。综合以往的研究不难看出，地塞米松作为一种模型药物负载于生物材料中具有较好的研究依据和背景。但在金属表面负载药物的研究一直以来是组织工程研究的难点。本实验将地塞米松负载到二氧化钛纳米管上，并构建了明胶/壳聚糖多层膜复合结构，进一步评价了其药物释放性能，为构建新型生物活性钛种植体提供新的参考。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
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材料方法

设计：对比观察实验。

时间及地点：于2012年11月至2013年4月在重庆医科大学生命科学院、重庆大学化工学院及生物医学工程学院完成。

材料：

实验方法：

实验流程示意图：

阳极氧化法制备二氧化钛纳米管：首先，将钛箔片剪裁成面积1 cm×1 cm大小的样本，然后依次使用体积分数75%乙醇，丙酮，异丙醇，体积分数75%乙醇，双蒸水超声清洗15 min，氮气干燥。钛箔片为阳极，铂片为阴极，电解液为含0.27 mol/L氟化铵的丙三醇溶液(丙三醇与水的体积比1∶1)，在电压20 V条件下电解3 h制备二氧化钛纳米管。使用大量蒸馏水清洗已制备的二氧化钛纳米管，氮气干燥备用。

扫描电镜观察二氧化钛纳米管的形貌：将所制备的二氧化钛纳米管样本固定在样品台上，旋转蒸镀仪喷金，使用场发射扫描电镜观察，照片记录。计算二氧化钛纳米管管径平均值。

载药：使用二氧化钛纳米管作为载药装置负载地塞米松。使用PBS溶解地塞米松，制备质量浓度5 g/L的地塞米松溶液。吸取40 µL地塞米松溶液滴加到二氧化钛纳米管表面，均匀涂布，注意勿使地塞米松溶液溢出二氧化钛纳米管样本外面，以保证每个样本表面的地塞米松负载量相等。室温干燥6 h。由于二氧化钛纳米管的毛细作用且具有较大比表面积，含地塞米松的溶液能被吸附到纳米管内。为证实地塞米松已经成功负载于纳米管内，实验进行了药物释放实验。

在负载地塞米松的二氧化钛纳米管表面制备明胶/壳聚糖多层膜复合结构：使用PBS配制10 g/L的明胶溶液。用0.3%(体积比)的醋酸溶液配制10 g/L的壳聚糖溶液。然后吸取100 µL明胶溶液滴加在负载地塞米松的二氧化钛纳米管表面，在自旋仪上以4 000 r/min的速度摇晃40 s，超纯水清洗数秒(由于负载于二氧化钛纳米管的地塞米松表面干燥后涂覆明胶及壳聚糖膜结构，超纯水清洗时间短，且有明胶及壳聚糖膜的覆盖，默认不会引起地塞米松的流失，此方法在文献[4]里已经被证实)，然后吸取100 µL壳聚糖溶液以相同的方法滴加在样本表面，在自旋仪上以4 000 r/min的速度摇晃40 s，超纯水清洗。重复添加明胶壳聚糖膜的步骤5次，以获得每个负载地塞米松的二氧化钛纳米管表面明胶及壳聚糖交替各6层，共12层。扫描电镜观察在二氧化钛纳米管表面涂覆明胶/壳聚糖多层膜结构后的形貌。

在制备明胶/壳聚糖多层膜结构的过程中，每涂覆一层进行接触角测试，每层检测5个样本。检测用初始蒸馏水滴体积为5 μL，待水滴稳定30 s后，用相机拍照记录，然后测量分析。

药物释放实验：同时将5个载药样本置于5 mL PBS中，37 ℃静置。3，6，12，24，48， 72，96，120，144，168，240及336 h后，分别吸取500 μL液体，使用紫外分光光度计在波长242 nm下检测吸光度值，然后添加500 µL新鲜PBS，根据校正曲线来计算药物释放量。每个样本的地塞米松释放量=释放总量/样本的数目。地塞米松的累积释放率(%)=地塞米松在每个样本的释放总量/每个样本的初始载药量×100%。重复3次实验。

扫描电镜观察明胶/壳聚糖多层膜复合结构的降解：将已制备的覆盖有明胶/壳聚糖多层膜的二氧化钛纳米管样本置入2 mL PBS中，37 ℃静置24 h后扫描电镜观察样本表面形貌。

主要观察指标：二氧化钛纳米管的微观形貌；二氧化钛纳米管表面明胶/壳聚糖膜结构的形貌；铺膜过程中的材料表面接触角变化；药物释放性能。

统计学分析：所有数据均以x(_)±s表示，采用SPSS 19.0统计学软件。用Graphpad prism 5作图。

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讨论

钛及钛合金具有低弹性模量，良好的拉伸强度、生物相容性及抗腐蚀性能，因而被广泛应用于骨科及牙科种植体材料领域^[11^，^20]。但其具有生物惰性，在种植体植入的早期阶段不易刺激种植体周围骨形成^[12]。长期的临床观察及研究发现，钛种植体的骨整合速度及能力尚不十分理想，种植体脱落及种植体周围炎的发生率仍较高^[21]。体内研究报道钛与周围骨组织的化学结合性能较低，主要是由于纤维组织过早长入种植体的表面并将其包裹，使得种植体与周围骨组织界面脱离，从而导致种植体的松动脱落^[13-14]。因此，以钛为基底的种植体表面应当具备良好的骨结合性能，这对于种植的成功来说至关重要。许多研究表明种植材料的表面性能是影响骨结合的重要因素^[15-16]。学者们提出了许多关于钛表面的处理方法，如硼砂，酸碱处理，羟基磷灰石涂层等^[17-19]，以达到提高钛种植体骨整合速度及降低种植体失败概率的目的。从微观结构看，上述处理办法主要集中在微米级结构的修饰。

材料的生物相容性与其表面性能密切相关，如表面粗糙度、拓扑结构及化学组成等^[20]。许多研究表明，微米级粗糙程度的材料表面具有局限性，在促进成骨细胞分化的同时也会抑制成骨细胞的增殖^[21-23]。Liu等^[24]研究表明纳米级粗糙程度的材料表面可改善微米级粗糙程度材料的缺点，更能促进细胞向成骨分化。骨组织是由无机磷酸钙、有机蛋白及胶原纤维组成的天然纳米级结构^[27-28]。随着纳米技术的发展，为模拟适宜骨细胞生长的天然纳米级生理环境，在种植体表面构建纳米结构日益吸引了众多研究者的目光^[25-26]。纳米材料由于具有相对较大的表面积，可提供蛋白吸附位点及加强细胞与种植体表面的反应，进而促进体外细胞黏附及体内骨结合^[29]。纳米材料因此吸引了研究者们的广泛关注^[30-32]。许多研究表明，在钛种植体表面制备二氧化钛纳米管是具有应用前景的表面改性方法^[5^，^33-36]。本实验采用了简单、经济的阳极氧化法来制备二氧化钛纳米管结构，扫描电镜观察二氧化钛纳米管形貌已形成且结构完整，符合实验设计的需要。

随着生物材料的发展，在种植体的表面构建功能性的药物释放系统成为一种发展趋势^[37-41]。Macdonald等^[39]在种植体表面构建了富含抗生素的多层缓释结构。Hu等^[1]在种植体表面构建了纳米颗粒载药系统并发现此结构可保持体内的骨平衡。其后续研究在种植体表面构建了仿生胞外微环境，利用二氧化钛纳米管负载骨形态发生蛋白2^[4]。Lai等^[3]也利用二氧化钛纳米管作为载药装置，表明二氧化钛纳米管在纳米载药材料方面具有优势。地塞米松具有止痛，消炎，止吐等性能，是在临床上广为应用的一种合成糖皮质激素，具有促进骨髓间充质干细胞向成骨分化的作用^[8]。相对于骨形态发生蛋白2，地塞米松的成本更低。明胶^[42]、壳聚糖是安全无毒的天然高聚物^[43]，具有良好生物相容性及生物可降解性，可应用于抗菌、止血、及制备控释材料等。优良的控释药物载体材料应当具备良好的生物相容性，适合负载各类药物，保护药物生物活性，可改善生物材料的表面性能，可药物控释及对某个器官或细胞的靶向给药等性质。明胶及壳聚糖具备上述性能，是优良的药物控释材料^[42-44]。文献[4]报道，壳聚糖分子带正电荷，明胶分子带负电荷，明胶/壳聚糖多层膜的构建基于静电吸附作用。本实验将地塞米松采用滴加法负载到二氧化钛纳米管上，并构建明胶/壳聚糖多层膜药物缓释结构，为构建新型生物活性种植体提供参考，以期降低种植体的成本。

为了研究明胶/壳聚糖多层膜在载有地塞米松二氧化钛纳米管表面构建的情况，实验进行了接触角测试。结果发现未载药的二氧化钛纳米管表面接触角约为16.4°，具有高度亲水性，与Balaur等^[40]的报道相似。实验还发现涂覆明胶/壳聚糖膜后，材料表面的接触角明显增加，从第5层开始出现了在48.0°与65.3°之间一高一低的交替变化，说明从第5层开始，明胶及壳聚糖膜已完全覆盖二氧化钛纳米管表面，接触角的交替变化主要是因为明胶和壳聚糖物理性能的区别所至，这与Hu等^[4]报道相似。且扫描电镜的结果也表明明胶/壳聚糖膜已经完全覆盖二氧化钛纳米管表面，完全封堵了纳米管管口。

为了研究已制备的负载地塞米松二氧化钛纳米管载药系统的药物释放性能，实验进行了药物释放实验。实验发现在最开始的3 h出现轻微暴释现象，约32.7%的地塞米松释放出来，这可能是明胶/壳聚糖多层膜附近的地塞米松直接释放出来所导致结果，与文献[45]报道的多层膜降解规律相似。文献[4]报道明胶/壳聚糖多层膜结构具有保护超氧化物歧化酶活性的作用，且为超氧化物歧化酶的释放提供了一个保护屏障，以实现缓释功能。实验发现3 h之后出现药物缓慢释放现象，24 h后约52.3%的地塞米松释放出来， 7 d后仅有极少量的药物从纳米管中释放出来。二氧化钛纳米管内保存的地塞米松为8.0%-10.0%。由最初的轻微暴释现象，到药物缓释现象，再到最后几乎检测不到地塞米松从二氧化钛纳米管内释放出来的平台期，这与之前Su等^[10^，^41]所发现的药物释放规律相似。研究表明本实验所制备的负载地塞米松二氧化钛纳米管载药系统具有缓释功能。

实验成功构建了二氧化钛纳米管负载地塞米松的缓释系统，但未探索此结构的生物学性能，在后续研究中课题组计划将进一步测试此结构的生物学性能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
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负载地塞米松二氧化钛纳米管缓释系统的构建

Constructing a controlled-release dexamethasone-loaded titania nanotube system

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